コレラ菌が固い面に張りつく仕掛けを切り出したら、水の中で効く接着剤になった

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濡れた面に接着剤を塗ってもたいていうまくいかない。売られている接着剤は、乾いてきれいな面に塗って固めることを前提に作られている。ところが、沈んだ機械や水中の構造物を直す場面、体の中の濡れた組織を縫わずに閉じる場面では、水の中で効く接着剤がどうしても必要になる。この分野の分子設計は長いあいだイガイを手本にしてきたが、イェール大学の Xin Huang さんと Jing Yan さんらは、まったく別のところから配列を1本持ってきた。コレラ菌のバイオフィルムである。論文は11月6日の Science Advances に載った。

イガイを手本にした設計が抱えていた弱点

水中接着剤の研究でいちばん調べられてきたのは、イガイが岩に体を固定するときに出す足糸（そくし）のタンパク質、mussel foot protein（Mfp）だ。カギになるのは DOPA（ドーパ）というアミノ酸で、ベンゼン環に水酸基が2つ付いたカテコールという構造を持つ。この構造が、水素結合、金属との配位、π電子を介した引き合いなど、いくつもの手で相手の表面をつかむ。DOPA を組み込んだ合成高分子は、実際に水中接着剤として作られてきた。

ただ、DOPA は化学的に反応しやすい。それが接着力の源なのだが、裏を返せば酸素や pH に振り回されやすいということでもある。環境が複雑になると性能が落ち、何がどう効いているのかを突き止めるのも難しくなる。フジツボ、マダニ、イソギンチャク、ヒトデ、ホヤ、タコを手本にした試みもあるが、どれも「海の生き物の接着を真似る」という同じ路線の上にある。

何十億年も水中で貼りついてきた細菌という手本

イェール大のチームが目を向けたのは、バイオフィルムだった。細菌が表面に取りついて、自分たちで作った粘り気のある物質に埋もれて暮らす形のことで、歯の表面のぬめりや配管の内側のぬるぬるがこれにあたる。感染や生物付着（フジツボや藻が船底に取りつくあれ）の現場にも必ず出てくる。細菌はこの暮らし方を何十億年も続けてきたので、水中で物を貼りつける工夫の蓄積という点では、イガイよりずっと先輩になる。

なかでも研究室がずっと扱ってきたのが、コレラ菌（Vibrio cholerae）のバイオフィルムだ。ビブリオ属は海の細菌の大きなグループで、塩の濃い環境でいろいろな表面にバイオフィルムを作る。チームは2023年に、バイオフィルムの中にある Bap1 と RbmC という2つのタンパク質が「両面テープ」のように働いていることを報告している。片側の面でバイオフィルムの主成分である多糖をつかみ、反対側の面で外の世界をつかむ。RbmC は宿主の細胞表面にある糖鎖を狙うのに対し、Bap1 のほうは、ガラスやプラスチックのような生き物でない表面に貼りつく担当だった。

その Bap1 のどこが貼りついているのかを調べていくと、タンパク質の中に飛び出した57個のアミノ酸のループに行き着いた。415番目のチロシンから471番目のリシンまでの部分で、チームはこれを Bap1-57aa と呼んでいる。この部分を取り除いたコレラ菌は、ガラスにバイオフィルムを作ってもすぐ洗い流されてしまう。

本体から切り離しても働いた57アミノ酸

おもしろいのはここからだ。この57アミノ酸の配列を化学合成して、タンパク質の本体から切り離した短いペプチドとして水に溶かす。すると、バイオフィルムとは何の関係もない状況でも、ガラスの表面や脂質の膜にひとりでに貼りついた。つまり、周りのタンパク質の助けなしに、この配列だけで接着の仕事が成り立っている。

今回の論文は、この一本のペプチドを接着剤として使えるのかを、顕微鏡・計算・力の測定の三方向から調べたものだ。ペプチドの端に蛍光色素を付けて、直径5マイクロメートルの微小な球に吸着するかどうかを共焦点顕微鏡で見ると、ガラスと同じシリカの球にも、ポリスチレンの球にも、表面に別の化学基を付けた球にも、同じようについた。濃度を上げていくと0.5〜1マイクロモル程度で頭打ちになり、球の表面がペプチドで埋まったことを示していた。比較のために置いた蛍光色素付きのデキストラン（くっつかないはずの糖）はほとんど反応しなかった。

どのくらい強く貼りつくのかを別の方法でも測っている。水晶の振動子にシリカの膜を張ったセンサーにペプチドを流し、振動数の変化から吸着量を読む装置（QCM-D）にかけると、水で洗い流しても振動数は戻らなかった。イソプロパノールでもエタノールでも落ちない。界面活性剤を流したところでようやく元に戻ったので、いったん貼りついたペプチドはそう簡単には剥がれないらしい。振動数の変化の大きさから見積もると、吸着していたのはちょうど分子1層ぶんだった。

決まった形を持たないという仕掛け

57個のアミノ酸のどこが表面をつかんでいるのかは、並びを書き出すと見当が付く。8文字でひとまとまりの似た並びが4回繰り返されていて、その真ん中にトリプトファン・フェニルアラニン・フェニルアラニン・グリシンという疎水性の短いつなぎが挟まっている。プラスの電荷を持つ残基が8個、マイナスが3個で、全体では正味プラス5。繰り返しの中に塩基性のアミノ酸が規則的に現れる形になっている。

チームは、繰り返しを2つに削ったもの、真ん中のつなぎを別の配列に替えたもの、真ん中の10アミノ酸だけを切り出したものを作って、どこが効いているのかを一つずつ確かめた。結果はきれいに分かれた。マイナスに帯電したシリカの表面では、繰り返しの中の塩基性残基が静電的に効いていて、真ん中の疎水的な部分はほとんど貢献しない。いっぽうポリスチレンの表面では、真ん中の部分も繰り返しも両方が効く。相手の表面の性質によって、同じペプチドの違う場所が働いているわけだ。

そして、このペプチドには決まった立体構造がない。いわゆる天然変性ペプチドで、溶液中ではβ構造とランダムな鎖が混ざった状態をとっている。脂質の膜に触れるとβヘアピンという形に折りたたまれて膜に差し込まれ、マイナスに帯電したガラスの上ではαヘリックスが優勢になる。分光測定と全原子の分子動力学計算が、どちらもこの姿を示した。決まった形を持たないからこそ、相手に合わせて折りたたみ方を変えられる。イガイのように反応性の高い化学基を1つ用意して力を集めるのではなく、形の自由度のほうで勝負している。

この違いは実用上も意味を持つ。DOPA がないぶん、酸素や pH の影響を受けにくい。翻訳後の化学修飾も要らないため、細菌に作らせて発酵で量産する道が開ける。配列をいじるのも、DOPA を使う分子よりずっと簡単だ。ほかの組み換えタンパク質の中にこの配列を埋め込んで、そのタンパク質を狙った表面に貼りつけるという使い方も考えられる。

濡れたままのガラス2枚を貼り合わせた強さ

ここから先の数値は、この研究が今年8月に bioRxiv に出した査読前の先行版で確かめたものだ。掲載版の本文は取得できなかったので、最終版で数字が多少動いている可能性は残る。

まず微小なスケールの測定。原子間力顕微鏡のカンチレバーの先にシリカの球を付け、ペプチドを吸着させてから、水の中でマイカ（雲母）の面に近づけて引き剥がす。引き剥がすのに要した力は、元の配列のままのペプチドで11.5ナノニュートンだった。真ん中だけの短いペプチドや、つなぎを替えた変異体では3分の1以下に落ちる。吸着しやすさの順番と、そのまま一致した。この力から接着の仕事を見積もると1平方メートルあたり1ミリジュールほどで、これまで報告されてきた水中接着ペプチドの範囲に収まる。

次に、目で見える大きさでの試験。ペプチドを1ミリリットルあたり8ミリグラムの濃さで溶かし、2枚のガラス板の端を重ねた間に挟んで、濡れたまま横方向に引っ張る（重ね合わせせん断試験）。接着強さは80キロパスカルを超えた。同じ濃さのウシ血清アルブミン（接着しないタンパク質の対照）とは、はっきり差が付いた。Mfp をもとに設計された分子を同じくらいの濃度で使った報告と、ほぼ同じ水準に並んだ。

そしてここが意外なところで、純水よりも、海水と同じくらいの塩濃度（400ミリモルの食塩水）のほうが強かった。静電的な引き合いで貼りついているなら、塩のイオンが電荷を遮るので弱くなるのが筋だ。チームは、塩が効いているのは接着する側ではなく固まる側だろうと見ている。ペプチドは疎水的な部分でおたがいに引き合い、プラスの電荷で反発している。塩がその反発を遮ると、ペプチドどうしが固まりやすくなって、接着層そのものがちぎれにくくなる——そう考えると説明がつく。海の中で使うことを想定した接着剤としては、ありがたい方向の性質だ。

濁った水を澄ませるという別の使い道

顕微鏡で球への吸着を見ているあいだに、チームはペプチドが自分同士でも固まりたがることに気づいた。表面に貼りつく性質と固まる性質を合わせれば、水に浮いた細かい粒を集めて沈ませる凝集剤になるのではないか。

そこで、直径200ナノメートルのポリスチレンの粒を汚れに見立てて水に分散させ、蛍光色素を付けたペプチドを加えてみた。濃度が低いうちは、粒の表面にペプチドが張りつくだけで粒はばらばらに漂っている。濃度を上げていくと、粒とペプチドが網目状につながった大きな塊ができ、水中に残る粒の数が減っていった。1マイクロモルを超えると、ほとんどの粒が塊の側に取り込まれた。ペプチドだけでも固まるのだが、粒が混じったほうが塊は締まった形になる。粒がペプチドを集める働きもしているらしい。

量産に向けた一歩と、残っている課題

化学合成したペプチドは測定には向くが、実際に使う量を作るには高すぎる。そこでチームは、この配列を大腸菌に作らせることを試した。発現自体は成功し、菌体の中に固まり（封入体）としてできたペプチドを、特定の界面活性剤を使って溶かし出すところまでは進んだ。ただ、その先の精製は難しかった。ニッケルのカラムで精製しようとすると、ペプチドが固まってしまって通らない。結果として、大きなタンパク質や DNA の断片が混じった粗い標品をそのまま使っている。接着ペプチドは精製しづらいことが知られていて、Mfp でも同じ苦労が報告されている。

裏を返すと、細かく精製しなくても接着の働きは残っていたということで、量産を考えるなら手間の少ない工程で済むほうが都合がよい。とはいえ、不純物や界面活性剤、精製用のタグが性能にどう効いているのかはまだ分かっていない。

もうひとつ、測定法によって結果の順番が入れ替わる点も、論文は正直に書いている。別の装置（表面力測定装置）でマイカの面どうしを使って測った以前の研究では、真ん中の10アミノ酸だけのペプチドのほうが、57個そろったものより成績がよかった。接着力は「相手の表面にどれだけつくか」と「ペプチドどうしがどれだけ強く結びつくか」の両方で決まるうえ、装置の形や引き剥がす速さでも変わる。今回の原子間力顕微鏡の手順では球の表面をまずペプチドで覆う必要があるので、吸着しやすい57アミノ酸のほうが有利に出たのだろうと考えている。

使うのは57個のアミノ酸の並びだけ

出どころはコレラ菌だが、この接着剤に使うのは57個のアミノ酸の並びだけで、菌そのものも毒素も関わらない。その並びを大腸菌に作らせられることまで、今回示されている。もともとこの配列が進化したのは脂質の膜に貼りつくためらしく、だからこそ無機物の表面と生体膜の両方に効く。現実の表面は脂質やタンパク質の残りかすで汚れていることが多いから、両方に貼りつけるのは強みになる。すでにこの配列をキトサン系の高分子に組み込んで、粘膜に貼りつく材料にした報告も出ている。

水中接着剤の手本の棚に、海の生き物とは別の段ができた、というのが今回の話だ。バイオフィルムは普段は厄介者として扱われ、どう剥がすかばかりが議論されてきたが、その剥がれにくさの正体を分子まで下りて掴めば、使う側に回れる。コレラ菌のバイオフィルムは接着の研究がいちばん進んでいる例のひとつで、ほかの細菌にも似た配列がまだ埋まっているはずだ。

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